Hemoglobinas modificadas de Tercera Generación.

Hemoglobinas modificadas de Tercera Generación.

Que consisten fundamentalmente en la utilización de determinadas formas farmacéuticas galénicas de microencapsulación se usan los liposomas (fosfolípidos no inmunogénicos y grasas neutras. Son vesículas esféricas cerradas con un medio intenso acuoso y una capa externa lipídica. A las pocas horas, el 50 % de los liposomas se aclaran de la circulación por el sistema retículo-endotelial del hígado y bazo. La activación del complemento permanece como un problema en el uso de éste tipo de sustancias. El producto Neo Red Cells de Terumo, que incluye liposomas con Hb humana, DPFG y catalasa. (En estudio clínico en éstos momentos).
Esta carrera tecnológica ya se inició en 1957. Frecuentemente se les añade análogos del ácido siálico a la superficie de la membrana para incrementar el tiempo de circulación. Los diámetros de las nanopartículas empleadas fueron de 1 a 5 micras, pero posteriormente se ha ido reduciendo el diámetro de éstos compuestos. Hasta el punto de llegarse a un tamaño de 0,2 micras de diámetro.
Estos liposomas son fagocitados por el Sistema Retículo Endotelial y esto conlleva que la resistencia a las infecciones está disminuida y además se potencia las reacciones anafilácticas y el sistema de los leucotrienos que causa inflamación.
Para obviar éste problemas se disminuye aún más el tamaño de molécula y la nanotecnología llegó a productos de 0,15 micras de diámetro. La membrana de éstas nanocápsulas está hecha casi exclusivamente de polímeros biodegradables, además los polímeros son más fuertes y más porosos que los lípidos,
Concretando a aspectos prácticos, la Mayoría de ésos productos no van a estar disponibles antes de los próximos dos años y genéricamente se les denomina “Transportadores de oxígeno basados en la modificación de las hemoglobinas” (hbocs de sus siglas en inglés). Los ensayos clínicos que se han hecho administrando éstos productos a atletas y viendo su resistencia al ejercicio aeróbico han demostrado que son útiles y que los resultados eran equiparables a la transfusión sanguínea autóloga. Estos estudios mostraron una equivalencia fisiológica en la que 1 mg del polímero de hemoglobina era similar a 3 mg de hemoglobina humana procedente de autotransfusión autóloga.
Si estudiamos atentamente la curva de disociación de la hemoglobina vemos que por muy sofisticados que sean los llamados “HBOC” acrónimos del inglés para denominar a éste grupo de sustancias transportadoras de oxígeno basadas en modificaciones de la hemoglobina, nunca podrán considerarse equipotentes a la sangre fresca de una transfusión autóloga u heteróloga, salvo que empleemos PFC o perfluorocarbonos en emulsión de más del 60 %. Estos últimos compuestos ya estudiados en el grupo uno siguen la Ley de Fick de difusión simple, y – por lo tanto - podrán llegar a transportar oxígeno en proporciones superiores a los otros compuestos artificiales.
Las formas de detectar están sustancias son –por lógica- cuidadosamente obviadas en el presente trabajo, por razones obvias, pero no seremos demasiado oscurantistas si decimos que para el analista experto, la diferenciación entre la hemoglobina modificada de la procedente de la lisis de los glóbulos rojos es relativamente sencilla.

Dopaje por transportadores de oxígeno:modificadores de la Hemoglobina.

TRANSPORTADORES DE OXIGENO POR MODIFICACION DE LA HEMOGLOBINA

La pregunta es obvia: ¿para qué “complicarnos tanto la vida” usando los perfluorocarbonos que son difíciles de manejar teniendo la hemoglobina que es un producto “natural” del organismo? Pues fue la primera sustancia que se intentó utilizar extrayéndola de la sangre. El problema es que la hemoglobina que se obtenía era extremadamente tóxica. Además es bastante nefrotóxica, pues precipita a nivel de las paredes celulares de los glomérulos renales causando una rápida necrosis tubular y el consiguiente colapso del riñón.
La molécula de hemoglobina no modificada puede producir vasoconstricción con el consecuente aumento de la tensión arterial y disminución del gasto cardíaco. Este efecto se debe a que los tetrámeros se unen al óxido nítrico derivado del endotelio vascular e impiden su efecto vasodilatador.
Otros efectos tóxicos son la generación de moléculas altamente reactivas de radicales libres que favorecen el riesgo de infección.

La vida media de la hemoglobina libre de estroma es CORTA. Además la hemoglobina liberada de los eritrocitos pierde su capacidad para unir 2,3 DPG (difosfoglicerato), que es esencial para una baja afinidad por el oxígeno, expresada por la P50 (presión parcial de oxígeno cuando la sangre está saturada al 50 %). Esto resulta en una inaceptable unión demasiado alta (P50= 5 mm de Hg), con una desviación a la izquierda de la curva de disociación del oxígeno. Para ello se une a una molécula de Piridoxal fosfato (que tiene una similitud estructural parecida al 2,3 DPG) el cual va a reducir la afinidad por el oxígeno a los valores de sangre normal., que son de P50=26 mm Hg. El problema es que la hemoglobina piroxilada es muy inestable y de vida media demasiado corta.

FIG. 39 ESTRUCTURA DEL 2,3-DIFOSFOGLICERATO.
El siguiente paso que se intentó es conseguir una hemoglobina (que todos conocemos tiene una estructura TETRAMERA), que no se “descompusiera” en dos dímeros después de introducirla en nuestro organismo. Esto se podría evitar mediante diferentes “manipulaciones” y modificaciones que intentaremos explicar posteriormente. Esas uniones a moléculas que eviten su desintegración a dímeros podremos hacerlas fundamentalmente de dos maneras:
a) Uniéndolas genéticamente. Para ello se usa la ubicua y pluriempleada enterobacteriácea Escherichia coli.
b) Uniéndolas químicamente. Veremos con detalle que se emplean muchas sustancias, entre ellas
c) La tercera generación de Hemoglobinas se basa en “revestirla” o encapsulada.

La hemoglobina es el pigmento transportador de oxígeno fisiológico y de sobra conocido es que está formada de 4 subunidades tetrámericas. De forma natural se ha intentado modificar la estructura del grupo hemo introduciéndole radicales y sucesivas modificaciones con el fin último de aumentar su capacidad de transporte de oxígeno.
De todos es sabido que en la degradación de la molécula de hemoglobina aparecen dos dímeros (alfa beta y alfa 2 beta 2) de muy elevada nefrotoxicidad. (Esto es de sobra conocido en las patologías de rabdomiólisis o el denominado “Crush Syndrom”, y es esa aparición súbita de estos productos nefrotóxicos la que desencadena un fallo renal agudos con exitus del paciente.) Esta acción tóxica sobre el túbulo renal también se ve incrementada debida a la contaminación de la Hb con hierro, detritus celulares y grupo hemo libre.
Desde 1980 se están haciendo intentos por modificar esta hemoglobina de forma y manera tal que permita
a) Una mayor capacidad de transporte de oxígeno
b) Mayor longevidad y que pueda ser conservada en frío durante un año.
c) Modificar la afinidad de la Hb por el oxígeno (en condiciones fisiológicas la Hb se une ávidamente al oxígeno y no lo distribuye con facilidad o con eficiencia a los tejidos. Sabemos que ésta afinidad por los tejidos de la Hb se encuentra alrededor de los 2-5 mm Hg. y que éste proceso multifactorial está influenciado por el pH, la concentración de 2,3 difosfoglicerato, la temperatura y la existencia de restos de productos de la oxidación de los carbohidratos.
Se han desarrollado tres tipos distintos de hemoglobinas modificadas y éstas modificaciones han logrado que se aumente hasta un 25% el rendimiento de extracción de oxígeno.

METODOS FISICOQUIMICOS DE DOPAJE.

METODOS FISICOQUIMICOS DE DOPAJE.
TRANSPORTADORES DE OXIGENO.
Por el Dr. Juan Carlos López Corbalán

Aparecen en la sección III de la Citada l Lista Única Antidopaje.

III:1 INCREMENTOS EN LA TRANSFERENCIA DE OXIGENO
III.1.1 Dopaje sanguíneo. Se define el mismo como la administración de sangre autóloga, homóloga o heteróloga, de concentrados de hematíes o de productos similares de cualquier origen, realizada con fines diferentes a los terapéuticos.
III.1.2 Administración de productos elevadores de la captación, el transporte o la liberación de oxígeno. Este capítulo lo tratamos con especial cuidado pues creemos que es donde Mayores problemas van a aparecer por lo sofisticado del grupo.
La Eritropoyetina y sus derivados miméticos son fármacos que se utilizan habitualmente para tratar procesos patológicos en los cuales el hematocrito está descendido, como puede ser el caso de la insuficiencia renal crónica. Desgraciadamente también puede ser utilizada de forma ilegal para aumentar o incrementar el transporte de oxígeno, siendo agentes dopantes sofisticados y de difícil detección por los métodos habituales de análisis. (Cuando nos referimos a eso de “los métodos habituales de análisis, evidentemente estamos hablando como mínimo de la Cromatografía de gases asociada a espectrometría de masas: como mínimo.

Para empezar a hablar de un mínimo de eficacia en las reacciones de identificación la sensibilidad y la especificidad son materias claves y que en la detección de sustancias dopantes como la EPO y los derivados que a continuación describiremos, se hace necesario no sólo la voluntad “política e institucional” de acabar con el doping, sino también la presencia de personal técnico cualificado para estas técnicas. Y aún a pesar de eso, ya veremos que debido a las especiales características farmacocinéticas y bioquímicas de éstas sustancias, su detección es farragosa, complicada, difícil y técnicamente complicada.
No es objetivo de ésta colaboración él extendernos y profundizar en técnicas analíticas ni tampoco vamos a inmiscuirnos excesivamente en la fisiopatología de las hormonas favorecedoras de la eritropoyesis. Ya existen obras de Fisiología dedicadas a ello, pero bástese decir que hay unos finos mecanismos de regulación de éstas sustancias.
La EPO y los derivados EPO miméticos se usan en la Medicina Clínica en el tratamiento de determinadas patologías asociadas a una bajada de los niveles de la serie roja de la sangre (por ejemplo en estados de insuficiencia renal crónica), dejemos claro que es un fármaco de uso hospitalario, que no puede ser dispensado en la Oficina de Farmacia salvo muy especiales circunstancias y que tiene unas indicaciones concretas. Y también es evidente que hay un uso no autorizado de estas sustancias para aumentar la prestación deportiva porque al aumentar la masa eritrocitaria, aumenta el transporte de oxígeno a los tejidos.
De un modo muy esquemático vamos a estudiar las sustancias que aumentan el transporte de oxígeno a los tejidos clasificándolos por orden de sofisticación y de “novedad”, lo cual no quiere ni mucho menos significar que ésta sea la forma ortodoxa de estudiar estas sustancias. Como este artículo está orientado principalmente a entrenadores, médicos deportivos y atletas, hemos optado por éste criterio taxonómico, por lo cual piden disculpas a los puristas y a los sofistas habituales.

CLASIFICACION DE LOS FÁRMACOS AUMENTADORES DEL TRANSPORTE DE OXIGENO

1. Perfluorocarbonos.
2. Transportadores de oxígeno por modificaciones de la Hemoglobina
2.1 De Primera Generación.
2.1.1 De primera generación: tipo cross- linking.
2.1.2 De primera generación tipo polimerización
2.2.2 De primera generación tipo conjugado
2.2.3 De primera generación por ingeniería recombinante.

2.2 De Segunda Generación.
2.3 De Tercera Generación. Microencapsulación y liposomiales.
3. Basados en la regulación alostérica de la Hemoglobina. Tipo Benzafibrato y RSR13.
4. Sustancias EPOmiméticas.
4.1 Péptidos EPO miméticos
4.2 Metil indoles EPO miméticos
4.3 Inhibidores de la Hematopoyetic Cell Fosfatasa (ipcp.)
5. Eritropoietina recombinante humana (epo)
5.1 EPO alfa, EPO beta y Epo ómicron
5.2 Darbepoietina
6. Terapia génica.
7. Formas galénicas novedosas de la EPO.
8. Cámaras Hiperbáricas
9. Transfusión de sangre autóloga.
10. Otros.

1. PERFLUOROCARBONOS

A todos nos impactó mucho la foto de un ratón sumergido en un “líquido” que no se ahoga, sino que puede respirar (VER FOTO).
Fig. 34 Ratón sumergido en CFC, sobrevive

Ese “líquido” es un perfluorocarbono.
Entra en el mundo de la ventilación líquida a base de Perfluorocarbonos (PFC) diciendo que son moléculas biológicamente inertes formadas por largas cadenas de carbono flúor y cloro que fueron descubiertas en la década de los 60 por Legand Clark. El oxígeno tiene una gran facilidad (unas 500 veces más alta) para disolverse en éstas sustancias, pero éstos compuestos, a su vez son bastante hidrofóbicos (inmiscibles en agua). Por lo tanto para poder solubilizar los PFCs en agua necesitamos utilizar agentes surfactantes (que disminuyan la tensión osmótica). A tal efecto se utiliza frecuentemente la Lecitina de origen animal.
Desde los años 60 se sabía que los mamíferos podían sobrevivir sumergidos en líquidos orgánicos porque estas sustancias eran capaces de aumentar la distribución de oxígeno a los tejidos. Se sabía que estas moléculas posteriormente eran captadas por las células del sistema retículo endotelial (células de Küpffer) y posteriormente liberadas al plasma como un gas disuelto. La excreción de estas sustancias es muy lenta, pues se comprobó que seguía excretándose después de 10 meses. Sabemos que el número de megacariocitos disminuye marcadamente, al parecer estas sustancias “disuelven” las plaquetas que son “secuestradas” en el tejido hepático. Así, se añade un problema adicional al uso de los PFC, si las dosis son muy elevadas, se producen lesiones hepáticas (fundamentalmente se agota el sistema de defensa que suponen las células del sistema retículo endotelial que ejercen como es sabido una función de “filtro hepático”. Por eso, el volumen máximo que se transfunde de PFC experimentalmente no supera UN LITRO.
Otra propiedad de los PFC es la fuerte dependencia de la ley de Henry de las presiones parciales. La solubilidad del Oxígeno depende intensamente de la presión parcial de oxígeno y el oxígeno a presión atmosférica no tiene la solubilidad funcional necesaria que debe de ser como mínimo de 400 mmHg. Por lo tanto tenemos que usar la respiración asistida. Uno de éstos productos (el Perfloran) está siendo intensamente estudiado en Puschino (Rusia). Tiene como características especiales el que puede ser almacenado a temperaturas de entre menos 5 y menos 18 grados Celsius hasta dos años. Puede ser administrado con solución fisiológica, albúmina, glucosa y antibióticos y sus principales componentes son la Perfluorodecalina (c10f18)


Fig. 35 Estructura de los CFC

y la perfluorometilciclohexil piperidina (C12F23N).

Fig. 36. Estructura del C8F18








Como ya hemos incidido estas sustancias son fluidos sintéticos que presentan una alta solubilidad para el oxígeno. Son moléculas muy simples y lineales con esqueleto hidrocarbonado recto en las cuales se ha sustituido el hidrógeno por halógenos, por lo tanto elementos químicos con un electrón desapareado en su capa externa y que les da una alta reactividad química. La cadena hidrocarbonada puede igualmente ser lineal o cíclica, pero no aparecen orbitales sp2 con nube electrónica pi en su capa externa. Estas sustancias llevarían en oxígeno a aquellos territorios o tejidos donde su concentración es más baja, produciéndose el intercambio correspondiente con el dióxido de carbono.
Lo realmente interesante de esto es que estas sustancias siguen la Ley de Fick y liberarían el oxígeno por simple gradiente de difusión, por lo que “soltarían” el oxígeno más fácilmente que los glóbulos rojos. Con los Perfluorocarbonos llegaríamos a un 90% de difusión y con la hemoglobina de los glóbulos rojos, escasamente un 30 %. Sabido es que en la molécula de hemoglobina hay 4 subunidades que unirían y transportarían el oxígeno por una unión covalente. Por el contrario con los perfluorocarbonos el mecanismo es de difusión simple y seguirían simplemente la Ley de Henry de las presiones parciales. En definitiva y como consecuencia la concentración de oxígeno en una emulsión podría incrementarse varias veces simplemente incrementando la concentración en el aire inspirado por el paciente. El principal problema seria, por el contrario que tendríamos que utilizar concentraciones muy elevadas de éstas sustancias para que su efecto fuera remarcable.
Además nos encontramos que éstas sustancias son insolubles en agua, con lo cual tendríamos que usar agentes tensioactivos para favorecer la emulsión de los Perfluorocarbonos y su fagocitación por las células de la economía.

Estas sustancias tienen una nula farmacocinética porque no-se biometabolizan, aunque si que se distribuyen muy lentamente y luego son exhalados por vía pulmonar.
Entre sus propiedades físico-químicas nos encontramos que:
a) Son líquidos claros e inodoros.
b) Química y biológicamente inertes. Con peso molecular entre 460 y 520.
c) Alta solubilidad en gas.
d) Alta densidad.
e) Baja viscosidad.
f) Baja tensión superficial.
g) Radioopacos.
h) Fácilmente esterilizables.

Las primeras emulsiones de PFCs para uso clínico se desarrollaron a finales de la década de los 70 (Fluorsol®, producido por la Corporación de la Cruz verde, en Japón). En la década de los 80 se realizaron numerosos ensayos clínicos con éste compuesto. Inicialmente estaba propuesto para el tratamiento de la anemia, pero no fue aprobado por su escasa eficacia. Y vida media corta. En 1990 se aprobó por parte de la Food and Drug Administration para los pacientes de alto riesgo para la reoxigenación del lecho vascular coronario distal durante la angioplastia de balón. Además mostró capacidad para la perfusión de órganos en transplantes.
Dado que son inmiscibles en sangre y agua y deben emulsificarse para su uso intravascular.

Fig. 37. Estructura tridimensional de la Hemoglobina
1.1 Primera generación:
El más importante de éstos productos es el perfluoro tri propilamina al 6%, en mezcla con perfluorodecalina al 14%. La emulsión que se realiza está formada por poloxamero 188 y fosfolípidos. Se desarrolló en Rusia y China a mediados de los ochenta, en un intento de mostrar la superioridad deportiva de los atletas de la hoy extinguida Unión Soviética.

El principal problema que tiene éste compuesto es que contiene restos de perfluorotripropil amina, con una elevada vida media de más de 65 días. Además estos primeros productos presentan una muy baja solubilidad en oxígeno e incluso a elevadas presiones de oxígeno (po2 de 500 mm Hg) el producto apenas puede transportar 5 ml de oxígeno por cada 100 ml

1.2 Segunda Generación:
El ejemplo más característico es el Perfubrón al 58 % y su homólogo superior en la serie: el perfluoro decil bromuro al 2 %. Son compuestos muy estables que pueden conservarse a 10 grados Celsius más de un año. La emulsión debe protegerse igualmente con antioxidantes tipo alfa-tocoferol al 0.1 –0.2 %.
Otro producto de ésta generación sería el perfluoro 1,8 di cloro octano al 76 %, que tiene la ventaja de que puede utilizarse en infusión tan alta como el 90% sin elevados problemas de viscosidad.

Innecesario decir que ésta ultima generación tiene una muy superior capacidad de transporte de oxígeno y que estos productos están taxativamente prohibidos por el Comité Olímpico Internacional y su uso es severamente castigado.
Los métodos de detección más usados para éstas sustancias se basan o bien en el aire expirado o en niveles plasmáticos.
Se extraen con isooctano y luego se analizan por cromatografía de gases asociada a espectrometría de masas.

Entre los fármacos disponibles en el mercado nos encontramos el Fluosol® en emulsión (perfluorodecalina) que se dejó de usar por las desgraciadas reacciones de alergia anafilaxis y muerte súbita). El Pertoran® investigado con mucho secretismo en Rusia desde hace una década. El Oxygent® que es perfluoro octil bromuro que produce taquicardias supraventriculares reflejas. Según indica el Estudio Clínico aún no finalizado. El Oxycite® y Oxyflúor® con Perfluorodicromooctano). También tenemos aquí el Oxigent® del laboratorio Alliance Pharmaceutical Corporation de san Diego, que es una emulsión al 60% de Perfubrón (muy lipofílico con alta solubilidad en oxígeno). Su estabilidad es elevada (10 meses), y con una vida media entre 4-5 días. Y además fácilmente esterilizable con calor húmedo.
Otros usos de los PFCs caen dentro de la Medicina Intensiva, la ventilación líquida está siendo cuidadosamente estudiada porque muestran capacidad de reapertura de alvéolos colapsados por infiltrados en el tracto respiratorio en niños prematuros.